發(fā)展后脂轉(zhuǎn)染（基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染方法）和磁轉(zhuǎn)染（基于磁性納米顆粒的轉(zhuǎn)染方法），OZ Biosciences 通過設(shè)計和合成新型陽離子羥基化雙親多嵌段聚合物 (CHAMP) 改變了 Polyfection，該聚合物具有生物相容性、可裂解、 pH響應(yīng)性和雙功能。

我們基于CHAMP技術(shù)創(chuàng)建了一種全新的轉(zhuǎn)染劑，以區(qū)別于通常使用經(jīng)典轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行的轉(zhuǎn)染劑。這種新型雙功能共聚物具有生物相容性、可電離性和 pH 敏感性。它由三個部分組成，結(jié)合并引入了三個協(xié)同概念：

• 由于其電荷、pH 敏感和疏水特性， “穿過膜屏障"的概念。

• “隱形轉(zhuǎn)染"的理念是，DNA 一直受到保護(hù)、掩蔽和支持，直至被核吸收。

• 由于可生物降解和可裂解部分而產(chǎn)生的生物相容性概念

這種基于聚合物的轉(zhuǎn)染技術(shù)是一種優(yōu)化的遞送系統(tǒng)，由于改進(jìn)的遞送機(jī)制，可實現(xiàn)高效率和低細(xì)胞應(yīng)激。

Helix-IN DNA 轉(zhuǎn)染試劑，我們的新型CHAMP聚合物，具有經(jīng)典陽離子聚合物的所有特性，并通過核酸屏蔽核心增強(qiáng)，可降低細(xì)胞應(yīng)激，并具有可生物降解的特性；這導(dǎo)致轉(zhuǎn)染增強(qiáng)。

原則

雙功能雙共聚物結(jié)構(gòu)：DNA 包裝

這種新穎的CHAMP技術(shù)的特殊性來自于雙功能陽離子生物聚合物由三個部分組成，每個部分具有不同的特性和功能。

• 聚合物附近的第一部分將 DNA 結(jié)合并高濃縮，并有助于細(xì)胞質(zhì)輸送。

• 第二個成分是 pH 響應(yīng)性且可裂解的連接體，可通過促進(jìn)內(nèi)體膜不穩(wěn)定來改善細(xì)胞遞送。

• 具有確定和優(yōu)化分子量的第三部分充當(dāng) DNA 防護(hù)罩和核攝取促進(jìn)劑。

每個部分的分子量和長度（對于每種類型的聚合物都是一定的）是與整體轉(zhuǎn)染效率相關(guān)的重要參數(shù)。

螺旋-IN，我們的新型雙功能聚合物轉(zhuǎn)染試劑與其他病毒樣載體不同：DNA 在傳遞到細(xì)胞核之前對細(xì)胞是隱藏的。

它是如何工作的

1- 保護(hù)和血清穩(wěn)定性

的設(shè)計螺旋-IN，我們的新型CHAMP聚合物允許 (1) 帶正電荷的聚合復(fù)合物在溶液中穩(wěn)定，并且 (2) 不會隨著時間的推移而聚集。

CHAMP 聚合物的結(jié)構(gòu)、聚胺組成和接枝密度經(jīng)過微調(diào)和優(yōu)化，將聚合物復(fù)合物放置在溶解度不隨時間變化的精確界面上。此外，親水基團(tuán)巧妙地排列在聚合物內(nèi)，以降低與帶負(fù)電荷的血清蛋白（白蛋白……）的相互作用，從而更有效地定義基因載體。

聚合體保持完整，DNA 免受降解……

這種帶正電荷的雙功能聚合物具有增強(qiáng)的 DNA 結(jié)合特性，可在一定程度上保護(hù) DNA； DNA/聚合物正電荷比使 DNA 與聚合物結(jié)合，在保護(hù)核酸免遭血清酶降解方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。我們設(shè)計了這種聚合物，即使在 50% 胎牛血清中 37°C 孵育 24 小時也不會觀察到 DNA 降解。

2 - 細(xì)胞攝取

陽離子復(fù)合物主要通過靜電相互作用與細(xì)胞膜結(jié)合（圖1-1），大多數(shù)復(fù)合物通過內(nèi)吞作用途徑（巨胞飲作用、吞噬作用、內(nèi)吞作用）被細(xì)胞吸收。文獻(xiàn)記載最多的內(nèi)吞途徑之一是由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的（圖 1-2）。一旦被內(nèi)吞，復(fù)合物就會內(nèi)化到早期內(nèi)涵體中，其中 pH 值從 7.4（細(xì)胞表面）降至 6.0（內(nèi)涵體腔）。隨著內(nèi)體進(jìn)入晚期階段，pH 將降至 5。

圖 1. 多聚復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)運輸。聚合復(fù)合物表面過量的聚陽離子可以附著在細(xì)胞表面 (1) 并被靶細(xì)胞攝取或內(nèi)化，通常通過胞吞作用 (2)。一旦進(jìn)入內(nèi)體囊泡 (3)，質(zhì)子-海綿聚合物的更高程度的質(zhì)子化會導(dǎo)致離子流入，并且 pH 響應(yīng)連接體被裂解，釋放出第一個聚合物單元（藍(lán)色）。接頭疏水域的暴露有利于滲透壓的增加，從而導(dǎo)致囊泡膨脹和破裂 (4)。第三個單元（紅色）仍然與核酸結(jié)合，從而降低細(xì)胞對 DNA 的感知，并通過直接導(dǎo)入細(xì)胞核 (5a) 或通過微管運輸 (5b) 協(xié)助其核遞送。一旦進(jìn)入細(xì)胞核 (6)，DNA 就會被表達(dá)。

3- 內(nèi)體逃逸和 DNA 釋放

^{聚合復(fù)合物逃避內(nèi)體并通過與“質(zhì)子海綿"效應(yīng)}相關(guān)的陽離子聚合物緩沖能力將其貨物釋放到細(xì)胞核中。

質(zhì)子胺在酸性介質(zhì)中充當(dāng)弱堿，使內(nèi)涵體內(nèi)的 pH 值不穩(wěn)定：一旦進(jìn)入內(nèi)涵體，特定的 ATP 酶就會產(chǎn)生大量質(zhì)子流入，并由聚合物緩沖（圖 1-3）。質(zhì)子的大量持續(xù)流動伴隨著氯離子的被動進(jìn)入，導(dǎo)致水的積累。結(jié)果，囊泡膨脹直至內(nèi)體破裂，其內(nèi)容物被輸送到細(xì)胞質(zhì)中（圖 1-4）。

第一個聚合物嵌段起到這個作用。此外，pH 響應(yīng)性和可裂解的疏水部分增加了補(bǔ)充功能。事實上，在生理 pH 值下隱藏的連接體在酸性 pH 值下會暴露出來。這導(dǎo)致其裂解和疏水區(qū)暴露，從而促進(jìn)內(nèi)體膜融合/不穩(wěn)定。

在此階段，幾個重要的陷阱可能會損害轉(zhuǎn)染效率：

• DNA 逃離核內(nèi)體的能力是轉(zhuǎn)染的主要限制之一

• 人們普遍認(rèn)為，DNA 一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，必須迅速進(jìn)入細(xì)胞核以避免細(xì)胞質(zhì)降解

• 內(nèi)體（也在細(xì)胞表面）中存在細(xì)胞傳感器，可以識別外來核酸并誘導(dǎo)抑制轉(zhuǎn)染的保護(hù)性反應(yīng)

雙功能共聚物：在細(xì)胞內(nèi)，壓縮 DNA 的第一個塊具有高緩沖能力，有利于內(nèi)體膨脹，pH 響應(yīng)性可裂解接頭促進(jìn)膜不穩(wěn)定并將隱形 DNA 釋放到細(xì)胞質(zhì)中；第三塊保護(hù)并引導(dǎo)DNA進(jìn)入細(xì)胞核。

有哪些應(yīng)用？

Helix-IN ™ DNA轉(zhuǎn)染試劑

主要用途是用于體外和體內(nèi)應(yīng)用的 DNA 轉(zhuǎn)染。

CHAMP 技術(shù)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)染效果：更多 DNA 進(jìn)入細(xì)胞，DNA 以隱形模式傳送至細(xì)胞核，不會對細(xì)胞產(chǎn)生警報和壓力……該試劑非常適合優(yōu)先貼壁的永生化細(xì)胞系，例如 HEK-293、NIH-3T3、CHO 、COS、HeLa、MCF7、MEF、RPE、C2C12….

它非常適合多種 DNA 的共轉(zhuǎn)染。

在體內(nèi)，DNA 被濃縮并保護(hù)成小的聚合體，限制免疫反應(yīng)，并能夠在循環(huán)系統(tǒng)中導(dǎo)航直至交付。

協(xié)議是什么？

該方案很簡單：根據(jù)細(xì)胞類型，使用 1:1 至 3:1 的比例（每 µg DNA 1 µL 至每 µg DNA 3 µL）將轉(zhuǎn)染試劑直接與 DNA 混合。孵育 30 分鐘后，將復(fù)合物和加強(qiáng)劑添加到細(xì)胞上。

30 分鐘的孵育時間是該方案的基石，可實現(xiàn) DNA 的壓縮和保護(hù)。

在納米顆粒/DNA 復(fù)合物自組裝過程中，等待至少 30 分鐘以使共聚物和 DNA 形成穩(wěn)定的超分子納米顆粒至關(guān)重要。由于共聚物的多部分性質(zhì)，形成和穩(wěn)定復(fù)合物的時間比“簡單"聚合物稍長，“簡單"聚合物的復(fù)合物形成速度更快（10-20 分鐘）。

脂轉(zhuǎn)染和多轉(zhuǎn)染之間的主要區(qū)別是什么？

脂轉(zhuǎn)染和聚合轉(zhuǎn)染（分別是基于脂質(zhì)和基于聚合物的轉(zhuǎn)染）是兩種使用合成載體將核酸遞送到細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染方法。